懸浮細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染操作

　　知道懸浮細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染操作有什么嗎？讓我們一起來看看吧！

　　一、細(xì)胞轉(zhuǎn)染前的準(zhǔn)備

　　1、細(xì)胞：

　　貼壁生長細(xì)胞：一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，必須應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，轉(zhuǎn)染當(dāng)日的細(xì)胞密度以70-90%（貼壁細(xì)胞），最好在轉(zhuǎn)染前2-4 h換一次新鮮培養(yǎng)液。

　　懸浮細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前12-16 h進(jìn)行懸浮細(xì)胞傳代，傳代后適宜的細(xì)胞密度為20-40×104/mL。臺盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)保持活細(xì)胞比在95%以上。

　　提前將293F細(xì)胞的密度調(diào)整至合適的密度后（2×106-4×106細(xì)胞/ml）于37℃搖床培養(yǎng)2-4 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。注意，參與轉(zhuǎn)染的細(xì)胞必須是培養(yǎng)三代或以上的穩(wěn)定細(xì)胞株。

　　2、DNA：

　　使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，于生物安全柜/超凈臺用0.22μm濾頭過濾除菌。

　　3、稀釋液：

　　于生物安全柜/超凈臺用0.22μm濾頭過濾除菌。

　　4、轉(zhuǎn)染試劑：

　　轉(zhuǎn)染試劑如PEI溶液長期儲(chǔ)存于-20℃，不可反復(fù)凍融，溶液在4℃放置不超過一周。

　　二、操作步驟（懸浮細(xì)胞）

　　1、取一支已滅菌的Ep管，加入一定量的DNA，以相應(yīng)體積的300 mM NaCl稀釋，用槍頭混勻后靜置5 min；

　　另取一支已滅菌的Ep管，加入相應(yīng)體積的300 mM NaCl稀釋對應(yīng)體積的PEI溶液用槍頭混勻后靜置5 min（稀釋液與DNA、PEI的總體積應(yīng)為轉(zhuǎn)染體積的5%）。

　　將質(zhì)粒和PEI溶液混合，槍頭混勻后靜置一段時(shí)間，使DNA與PEI形成穩(wěn)定的聚合物。

　　2、從搖床中取出293F細(xì)胞。用1 mL移液槍滴緩慢滴加轉(zhuǎn)染混合液，邊加邊搖晃搖瓶使轉(zhuǎn)染更加充分。

　　3、轉(zhuǎn)染后將懸浮細(xì)胞置于搖床中培養(yǎng)，條件為37℃、8%CO2、110 rpm。每隔24 h進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并用臺盼藍(lán)染色液觀察細(xì)胞的存活率。

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