PCR引物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵點(diǎn)有哪些？

PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，因此，PCR的首要任務(wù)就是引物設(shè)計(jì)。那么你知道PCR引物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵點(diǎn)有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、引物最好在模板cDNA 的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)

DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對(duì)（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。

二、引物長度一般在15~30 堿基之間

引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

三、引物GC 含量在40%~60%之間，Tm 值最好接近72℃

GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm 值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。

四、引物3′端要避開密碼子的第3 位

如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。

五、引物3′端不能選擇A，最好選擇T

引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A 時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T 時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C 錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T 之間，所以3′端最好選擇T。

六、引物應(yīng)具有特異性

引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST 檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。

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