四正柏凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

相關(guān)介紹:細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對(duì)PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)te的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用Annexin V與PI雙染的方法，通過(guò)流式檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡。

儲(chǔ)存條件:2-8℃避光保存,勿冰凍。

有 效 期：一年

注意事項(xiàng):本試劑盒需使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。此產(chǎn)品僅供研究，不用于臨床診斷。

操作步驟：

1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

   a)對(duì)于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來(lái)時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000rpm左右離心5min，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無(wú)法完quan離心至離心管底，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。

   b)對(duì)于懸浮細(xì)胞：1000rpm左右離心5min，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無(wú)法完quan離心至離心管底，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。

2. 用去離子水按1:3稀釋結(jié)合緩沖液(4ml 4x結(jié)合緩沖液+12ml去離子水)；

3. 用1x結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1-5×106/ml；

4. 取100µl的細(xì)胞懸液于5ml流式管中，加入5µl Annexin V/FITC混勻后于室溫避光孵育5分鐘；

5. 加入10µl 20ug/ml的碘化丙錠溶液(PI)，并加400µl PBS，立刻進(jìn)行流式檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

空白管：陰性對(duì)照組細(xì)胞，不加Annexin V/FITC，碘化丙錠溶液(PI)。用于調(diào)節(jié)電壓?jiǎn)稳竟埽宏?yáng)性對(duì)照組細(xì)胞，只加Annexin V/FITC。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償

檢測(cè)管：處理的細(xì)胞，加 Annexin V/FITC，碘化丙錠溶液(PI)。用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

樣本分析：

1. 流式細(xì)胞儀分析：FITC 的最大激發(fā)波長(zhǎng)是 488nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)是 525nm，建議選擇FL1 通道檢測(cè)；PI-DNA復(fù)合物的最大激發(fā)波長(zhǎng)是 535nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 615nm，PI 的紅色熒光在 FL2 或 FL3 通道檢測(cè)。用FlowJo等軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點(diǎn)圖（two-color dot plot），F(xiàn)ITC 為橫坐標(biāo)，PI 為縱坐標(biāo)。典型的實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞可以分成三個(gè)亞群，活細(xì)胞僅有很低強(qiáng)度的背景熒光，早期凋亡細(xì)胞僅有較強(qiáng)的綠色熒光，晚期凋亡或壞死的細(xì)胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

2. 熒光顯微鏡觀察：

a)滴一滴用 Annexin V-FITC/PI 雙染的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞。

b)在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC 熒光信號(hào)呈綠色，PI 熒光信號(hào)呈紅色。

【注】：對(duì)于貼壁細(xì)胞，可直接用蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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