細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一，利用凍存技術(shù)將細(xì)胞冷凍保存在-196℃液氮中，可以使細(xì)胞暫時停止生長并保留細(xì)胞特性，以便在需要時再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。同時保存適量的細(xì)胞，可以防止細(xì)胞在培養(yǎng)過程中因受到污染或其他意外事件導(dǎo)致細(xì)胞丟種，起到細(xì)胞保種的作用。

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇采取“慢凍快融"的原則，慢速冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水份滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)形成冰晶的機(jī)會；快融以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，避免慢速融化水份滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)冰晶造成對細(xì)胞的損傷。

細(xì)胞凍存時需向培養(yǎng)基中加入冷凍保護(hù)劑，可保護(hù)細(xì)胞在冷凍時免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護(hù)劑可根據(jù)其是否穿透細(xì)胞膜分為滲透性和非滲透性兩類：

1.滲透性冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。

2.非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥YI基淀粉等。

（一）細(xì)胞凍存一般步驟

1. 準(zhǔn)備已滅菌的凍存培養(yǎng)液，并4℃預(yù)冷；

2. 選取對數(shù)生長期的細(xì)胞，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用細(xì)胞消化酶（如胰蛋白酶）進(jìn)行消化，適時去掉消化液，加入少量新鮮培養(yǎng)液。懸浮生長的細(xì)胞不進(jìn)行消化處理，直接將細(xì)胞收集于離心管中離心，1000 rpm，5-10 min；

3. 棄去上清液，逐漸加入適量預(yù)冷的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度在5×10⁶～1×10⁷/mL之間；

4. 將上述細(xì)胞分裝于2 mL凍存管中，每管1-1.5 mL。在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱、凍存日期和操作者；

5. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的降溫速率開始為-1～-2℃/ min，當(dāng)溫度降到-80℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-80℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

（二）細(xì)胞復(fù)蘇一般步驟

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃水浴中，并不時搖動使其盡快融化；

2. 從37℃水浴中取出凍存管，在無菌條件下取出細(xì)胞，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻，以1000 rpm，5-10 min離心；

4. 棄去上清液，加入適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度后接種到培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；

5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

（三）注意事項(xiàng)

1. 配制好的細(xì)胞凍存液要進(jìn)行預(yù)冷，新鮮配制的凍存液會產(chǎn)生大量的熱。

2. 凍存的細(xì)胞在半年后，建議取出一只凍存管細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察生長情況，然后再繼續(xù)凍存。